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PCR聚合酶链反应

时间: 2021-10-29 16:17:04 作者:

PCR聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是最基本、最为广泛应用的DNA突变检测技术。
PCR可以选择性地将单个DNA或RNA分子在几小时内迅速扩增至几百万倍以上,直接检测和分析患者特定基因的序列而不需要克隆及DNA印迹或RNA印迹分析的过程。
在检测中极少数细胞均可以直接用于PCR分析,因而可以不必从组织中抽提大量的DNA或RNA样本。
PCR的原理是用一对能分别与靶DNA双链序列配对的人工合成的寡聚核苷酸引物,在耐热DNA聚合酶(Taq)的作用下扩增目的DNA片段(见下图)。
重复热变性、引物复性及延伸的循环,靶序列的拷贝数会按指数成倍增长(可达10 6~7)。
PCR的操作流程如下:
(1)用加样器在Eppendorf反应管中加入下列成分:PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、引物混合液、基因组DNA模板、ddH 2O。
(2)在设定好的PCR仪上进行反应:95℃变性3分钟(第一轮循环);95℃变性30秒;56℃复性30秒;72℃延伸30秒;72℃延伸10分钟(最后一轮循环)。循环反应30轮(注意:复性的温度和时间依据靶DNA序列的长度和引物序列的不同而异)。
(3)反应结束后,取少许反应液进行琼脂糖凝胶电泳,确认是否有目的PCR产物。
另外,DNA染色后,可将PCR产物条带的浓度同分子量标志(marker)条带的浓度进行比较,估算大致的DNA量。
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